显微视觉反馈的单细胞精准融合操控平台构建及融合后生物学效应的原位解析

摘要 (Abstract)

细胞融合技术是细胞工程中的一项重要核心技术，在杂交瘤单克隆抗体的制备、癌症免疫治疗以及核移植等领域的应用上占据着不可替代的位置。但是传统的化学融合（如PEG）或者电融合的方法通常是以群体为单位进行，存在融合率低、配对随机性强并且在融合作用之后细胞的状态难以追踪等问题。

本项目针对上述问题，开发出一个利用显微视觉反馈的单细胞精准融合操控平台。采用计算机视觉算法和微型机器人协同控制的方法实现了对单个细胞进行精确配对接合，并且建立了在原位条件下解析其生物学效应的技术体系来探究胞重编程的过程所具备的优点也给提供了高精度的研究手段

1. 研究背景及问题

在微观尺度上对单个细胞进行“手术”级别的操作，需要很高的系统时空分辨率。传统的电融合腔室不能够控制特定的配对手段（比如把某种肿瘤细胞和树突状细胞结合在一起），而且融合作用之后产生的杂交细胞常常被淹没于未参加合并过程中的其它非活性或不活跃的状态中，并且无法实现单个细胞原位追踪的目的。

我们面临的主要问题为：

怎样在微米尺度上实现异种细胞的自动化识别和捕获？

怎样用视觉反馈闭环控制来达到亚微米级别的细胞配对精度？

怎样在不破坏细胞活性的情况下进行长时间的生物学效应监测？

2. 平台建设：显微视觉和纳米操控的有机融合

本平台集成了高倍倒置显微镜、精密三维微操作手和定制化的微流控芯片。主要创新就是加入了机器视觉反馈回路。

2.1 视觉反馈控制系统

系统使用了改进后的OpenCV边缘检测和形态学处理算法来实时提取视野中的细胞质心坐标以及轮廓特征。用卡尔曼滤波预测出细胞运动轨迹，然后动态地改变微针的移动参数以消除操作过程当中的机械抖动、漂移现象。

高精度显微操控与视觉反馈系统实验环境

2. 2 基于介电泳（DEP）的精准配对

为了使目标细胞发生物理接触，我们使用正介电泳力（pDEP）来促使细胞排队。相比于传统的光镊技术而言，在对被观察的生物组织造成热损伤方面该方法要小得多。通过精确调节交流电压场频率和幅值的方法把待融合的两个细胞(Cell A、Cell B)拉到阴阳极之间形成一个“哑铃状”的配对结构。

3. 融合策略及实施

完成细胞配对之后，平台就会施加微秒级的高压直流脉冲（DC Pulse）来击穿细胞膜接触区中的磷脂双分子层，并促使两者的融合。

关键技术指标：

配对成功率：> 92%

融合对准精度：± 1.5 μm

细胞存活率：融合24小时后 > 85%

细胞膜结构与融合原理示意图

4. 融合后生物学效应的原位分析

融合是第一步，而细胞核的命运决定了杂交后能不能正常工作。本研究用该平台对融合后的细胞进行了72小时的原位延时摄影（Time-lapse Imaging）和荧光分析。

4.1 细胞骨架重构和核融合

用荧光标记F-actin（丝状肌动蛋白）来观察，发现融合初期细胞骨架出现了剧烈的解聚和重组。视觉数据表明，在融合后的3到5个小时内两个核会逐渐靠近；到了有丝分裂期的时候，核膜破裂、染色体分开才算完成真正的基因交换。

4.2 基因表达的重编程

用微流控芯片原位杂交技术来比较融合前后关键转录因子的表达量。数据显示，融合细胞具有不同于亲本细胞的独特表型，并且证明了胞质混合对于核基因表达重编程的作用。

融合后细胞的荧光原位解析

5. 结论与展望

本案例成功地建立了一个集自动化控制、精准融合以及原位检测于一体的单细胞工程平台。

工程学意义：解决了传统融合技术“盲操作”的问题，把细胞融合从群体统计推向了单个细胞精准控制的新高度。

生物学价值：可视化原位解析展示了异种细胞融合早期的动态生物物理过程，为细胞治疗和再生医学提供了重要的数据支持。

未来，该平台还将进一步与人工智能（AI）图像识别技术相结合，在细胞形态表型的基础上进行全自动高通量筛选和融合，并加速新一代抗体药物的研发。