面向高效基因递送的精密方波电穿孔仪设计及其跨膜电位微观仿真研究

1. 项目背景及问题 (Background and Issues)

随着CRISPR/Cas9等基因编辑技术的发展，非病毒载体的基因递送系统也逐渐成为了生命科学领域中的研究热点。电穿孔（Electroporation）比使用病毒作为载体会更好一些因为它的无免疫原性以及可以应用到不同的细胞类型中来，在下一代基因治疗里被看作一个重要的工具。

但是传统的指数衰减波（Exponential Decay Wave）电转仪存在电压不可控、细胞热损伤大以及转染效率和存活率难以平衡的问题。本项目的主要问题在于：

波形精确控制：大功率输出时如何使微秒级方波的上升沿和下降沿快速，从而减小焦耳热效应。

微观机制的可视化：如何用仿真手段准确预测出不同电场参数下的细胞膜跨膜电压（Transmembrane Potential, TMP）的变化，进而指导实验条件优化。

基因递送微观概念图

2. 系统架构设计 (System Architecture)

为了解决上述问题，我们设计出一套使用 FPGA + IGBT 的高压精密方波脉冲发生系统。该装置去除了传统的电容放电方式，并且采用储能电容器和全桥逆变拓扑相结合的方式替代之。

核心技术指标：

脉冲电压：0～3000V连续可调（分辨率1V）

脉宽范围：10μs～100ms（精度< 100ns）

上升/下降沿：<500ns（1kΩ负载）

我们采用模块化的设计思路，主控单元利用光纤隔离来驱动高压侧的IGBT模块，并且可以避免高压干扰。在功率级电路中使用了有源钳位技术以消除由于寄生电感引起的大电压尖峰并且保证输出波形为标准“平顶”的方波形态。

高压脉冲发生器核心控制电路

3. 跨膜电位（TMP）的微观仿真研究 (Microscopic Simulation)

电穿孔的本质就是细胞膜在强电流的作用下发生极化，当跨膜电压达到一定阈值（大约 1V）的时候就会引起脂质双分子层的重排而形成亲水性的空洞。为了定量地描述该过程，在 COMSOL Multiphysics 平台上建立了单个或多个细胞悬浮液中有限元模型(FEM)。

仿真模型建立：

我们采用 Schwan 方程以及 Smoluchowski 漂移-扩散方程式，并且把电流场和孔隙密度演化方程耦合在一起：

仿真结果分析：

仿真结果表明，在方波脉冲的作用下，细胞两极（Pole）的跨膜电位很快上升并保持在平台期上，而赤道区域（Equator）的电位变化不大。相比于指数波而言，方波可以使得更多的部分得到有效的穿孔而不致死，并且有效地提高了形成通道的效果和均匀性，在1.0V到1.5V之间维持有效打开的状态

电场仿真与数据可视化分析

4. 实验验证及结果 (Experimental Validation)

我们用研制出的方波电穿孔仪对 HEK-293T 细胞和原代 T 细胞进行 EGFP 质粒转染实验，并与市场上主流进口设备进行了对比。

实验数据摘要：

转染效率（Transfection Efficiency）：在400V/cm、5ms的方波脉冲下，HEK-293T 的 GFP 阳性率能达到85%，比传统的设备提高了 20%。

细胞存活率（Cell Viability）： 经 PI 染色流式细胞术分析，细胞存活率达到 90%以上，并且说明了精密方波对细胞的热损伤很小。

荧光成像：在激光共聚焦显微镜下可以看到绿色荧光蛋白存在于细胞质中并且均匀高表达。

实验室环境下的显微观测

5. 结论与展望 (Conclusion)

本项目成功研制出具有纳秒级边沿控制能力的精密方波电穿孔系统，并通过多物理场仿真研究了方波提高基因递送效率的作用机理。该研究成果不仅可以给难转染细胞（干细胞、原代免疫细胞）进行基因修饰提供强有力工具，而且可以为后续不可逆电穿孔(IRE)肿瘤消融治疗打下理论和硬件基础。