时域组合双波形电场的细胞膜穿孔动力学及其大分子递送增效机制研究

摘要 (Abstract)

在基因治疗和药物递送方面，怎样高效又低毒地把大分子（质粒DNA、mRNA以及蛋白质）运送到细胞内一直就是生物医学工程的重要难题。传统的单极性微秒脉冲电穿孔技术虽然已经很成熟了，在大规模分量的运送效率上还是需要进行不断的优化调整来达到和保障好的结果，但是在高能量大强度的情况下常常会面临被破坏或者无法到达的目的地而受到损坏的问题。

本研究主要关注时域组合双波形电场（Time-Domain Combined Dual-Waveform Electric Field），利用分子动力学(MD)模拟和体外细胞实验相结合的方法，发现了纳秒级高压脉冲、毫秒级低压脉冲的协同作用。研究表明该种组合作用不仅能够使膜表面亲水性孔隙形成速度明显加快，并且通过“打孔-电泳”的方式也大大提高了大分子跨膜运输的能力。

1. 引言：打破传统电穿孔的局限性

细胞膜是一层非常绝缘的磷脂双分子结构，它是阻止外源性大分子进入胞内的重要屏障。传统的电穿孔技术（Electroporation）主要是利用单个参数为方波脉冲来造成跨膜电压超过阈值的情况，并且它能够使瞬时通路形成从而允许物质穿过细胞壁进行运输操作

但是目前的研究表明：

纳秒脉冲（nsPEF）可以产生高密度的超微孔隙，但是由于其孔径过小而不能够让大分子通过。

微秒/毫秒脉冲（msPEF）可以扩张孔径，但是长时间的高能输入容易造成焦耳热效应而引起不可逆细胞损伤。

因此，我们提出了一种时域上的双波形组合策略来解耦“成孔”和“递送”的两个物理过程。

时域组合双波形电场作用机理示意图

2. 动力学机制：从“成孔”到“拖拽”的接力

本研究的重点就是对电场波形进行精确控制。我们建立了一个全原子分子动力学模型来模拟POPC磷脂双层在两种不同的正弦型交流电磁脉冲下所表现出的响应过程。

2.1 第一阶段：纳秒高场强所引起的成核效应（Nucleation）

施加第一重高压纳秒脉冲（HV-ns pulse）的时候，膜的内外两侧都会产生很大的电荷密度差，并且在瞬间形成极大的麦克斯韦应力。模拟结果表明磷脂头基很快发生偏转，在大约5到10纳米的时间里水分子链就可以穿过疏水核心而生成一个疏水性的孔隙（Hydrophobic Pore），并且这个过程会迅速转变为稳定的亲水性孔隙（Hydrophilic Pore）。

2.2 第二阶段：低场强长脉冲电泳增效 (Electrophoretic Drag)

孔隙一旦形成，单纯依靠扩散作用大分子物质进入细胞的效率很低。此时第二重低压长脉冲（LV-ms pulse）介入了该电场强度虽然没有达到击穿阈值但是可以保持孔洞不闭合并且对带负电荷核酸施加明显的电泳力从而将它“拖拽”过孔隙

磷脂双分子层在组合电场下的孔隙演化分子动力学模拟

3. 实验结果和讨论

为了检验理论模型的可靠性，我们选择HeLa细胞系作为实验对象，并用FITC标记葡聚糖（70kDa）和GFP质粒来作递送材料。

3.1 递送效率的明显提高

实验比较了单一纳秒脉冲、单毫秒脉冲以及组合双波形脉冲的转染效果。流式细胞术（Flow Cytometry）分析表明，在相同能量密度的情况下，组合双波形组的平均荧光强度(MFI)是传统微秒脉冲组的3.4倍。

3.2 细胞活性最大化的保持

用CCK-8法检测细胞活力，我们发现组合波形能降低第二阶段电压幅值从而有效减少焦耳热的产生。实验组中细胞存活率一直保持在 85%以上，并且明显高于高压电穿孔对照组（约为60%）。

不同波形策略下的转染效率与细胞存活率相关性分析

4. 结论与展望

本研究系统地说明了时域组合双波形电场在细胞膜穿孔动力学中所具有的独特优势。其主要创新之处就是：

1. 用高频分量来实现低能耗的精准“打孔”；

2. 用低频分量来实现大分子的定向“电泳引入”。

“分而治之”的策略很好地解决了大分子递送困难、细胞损伤大的行业问题。脉冲发生器技术的小型化和集成化的趋势，使得该技术在CRISPR-Cas9基因编辑治疗、DNA疫苗的传递以及肿瘤不可逆电穿孔消融（IRE）增强疗法上具有很大的转化价值。